Действие Portal 2 начинается через несколько сотен лет после событий первой игры. Главная героиня, подопытная девушка Челл, приходит в себя в заброшенной, покрытой обильной растительностью Лаборатории исследования природы порталов (комплекс корпорации Aperture Science). Ей в руки снова попадает переносное устройство создания порталов, и целью Челл становится выбраться на поверхность. Она встречает Уитли — одного из модулей персональности, множество которых активировалось в конце Portal, и впоследствии они стали новыми хозяевами комплекса. Уитли оказывается обеспокоен положением Лаборатории и рассчитывает на помощь Челл, взамен показывая ей путь на поверхность. Вместе они продвигаются по разрушенным помещениям и всё ещё работающим цехам Aperture Science.